전체적인 총괄
* 이 연구에 대해서 간단히 요약해서 말해 보시오.
- 몸에 좋은 특정 식품을 섭취했을 때 어떻게 신체에서 영양분을 섭취하여 건강해지는지 에 대한 비밀 중 하나는 장내 미생물이 있습니다. 인체의 세포의 갯수는 약 30조개 입니다. 최근의 논문에 따르면 장내미생물의 숫자가 평균적으로 39조개라고 합니다. 즉 인간의 세포만큼의 미생물이 우리 체내에 살고 있는 것입니다. 이러한 장내 미생물은 음식물의 소화를 도와 영양분 섭취를 도울 뿐만 아니라 면역 체계에도 큰 역할을 합니다. 해당 논문에서는 부추처럼 생긴 봄나물 중 하나인 삼채가 어떻게 육계의 장내미생물에 영향을 미치고 이것이 생산성을 증가 시 킬 수 있는지를 연구하였습니다. 장내 미생물의 조성이 어떻게 변화하는지 연구하기위해 실험군을 나눠 육계에 여러 삼채의 부위를 섭취하게 하였으며, 해당 실험군의 대변샘플을 16s rRNA 시퀀싱을 수행하였습니다. 그 결과 특히 사료의 0.5%의 삼채잎 섞어 배급한 육계들에서 유의미한 장내미생물의 변화가 나타났으며 이것이 육계의 중량, 골밀도, 그리고 골밀도와 연관이 있는 것을 밝혀냈습니다. 따라서 삼채 잎이 육계의 장내 미생물의 조성을 바꿈으로써 유익한 영향을 준다는 것을 확인 할 수 있었습니다.
* 그렇다면 어떤 미생물이 육계의 생산성에 관련해 가장 큰 역할을 하였나요?
- 4개의 미생물(속레벨에서의)가 유의하게 양성대조군, 음성대조군과 비교하여 0.5%잎을 급여한 그룹에서 나타났습니다. 이 4개의 미생물은 전부 잎을 복용하였을 때 양이 유의적으로 감소하였습니다. 이는 삼채에 있는 알리신 성분이 향균 및 살균작용을 하여 유해균을 증식하는 것을 억제하는데 이러한 작용과 관련 이있을 것이라고 추측이 됩니다. 하지만 4개의 미생물이 어떻게 구체적으로 작용을 하는지는 알려져 있지 않아, 그 부분에 대해서는 추가적인 연구가 필요합니다. 미생물의 구성이 샘플 간에 얼마나 다른지 알아보기 위해서, 샘플 간의 다양성 지표인 weighted unifrac distance를 계산함. PCoA plot을 통해 계산된 weighted unifrac distance 를 시각화하고, 삼채 섭취군(L3, L5, R3, R5), 양성 대조군, 음성대조군간에 미생물의 양과 종이 얼마나 차이가 있는지 나타내 줌으로써, 삼채 섭취군의 전체적인 미생물 구성을 파악함.
Figure 1에서 leaf 0.5 를 제외하고, 그룹들간의 거리가 멀지 않고 구분이 잘 되지 않는 것을 확인 할 수 있음. 이는 미생물 구성의 차이가 그룹간에 크지 않음을 의미함. Leaf 0.5 그룹은 다른 그룹들에 비해 그룹 내 샘플들의 거리가 크지 않으며 음성대조군 및 양성대조군과 구분됨을 알 수 있음.
그룹 간 미생물의 차이를 통계적인 수치로 분석하기 위하여 PERMANOVA 분석이 수행되었음. PERMANOVA 분석은 그룹 내 샘플들의 거리와 그룹 간 샘플들의 거리를 통해 그룹 간의 차이가 얼마나 나는지를 통계적으로 제시해 줌. 그룹을 어떻게 구성하느냐에 따라 그룹간의 차이는 다르게 나타남. 삼채의 부위별 그룹 (L, R, 양성대조군, 음성대조군), 삼채의 수준별 그룹 (0.3, 0.5, 양성대조군, 음성대조군), 삼채의 부위별 수준별 그룹 ( L3, L5, R3, R5, 양성 대조군, 음성대조군) 에 따라 미생물 구성의 차이를 분석함. 삼채의 수준별 그룹은 유의한 차이가 관찰되지 않은 반면, 삼채의 부위별 그룹과 삼채의 부위별, 수준별 그룹은 유의한 차이를 나타냄 (P-value < 0.05). 이는 삼채의 뿌리와 잎이 닭의 장내 미생물 구성을 각각 다르게 변화시킨다는 것을 의미함.
Pair-wise test 를 통해 (1) 삼채의 부위별 그룹과 (2) 삼채의 부위별 수준별 그룹에서 어떤 그룹들끼리 미생물 구성에 차이가 있는지를 분석함. (1)에서 대조군과 부위별 그룹을 비교했을 때, 양성 대조군과 뿌리그룹간에는 그룹 간 구분이 힘든 것으로 보임. (2)에서는 세부적으로 부위별 수준별 그룹이 얼마나 구분이 되는지 알 수 있음. L3 과 L5 및 R3 과 R5 에서는 전체 미생물 양과 종의 차이가 없었음. 이는 같은 부위내 에서 양의 차이로는 전체 미생물 구성에 변화가 거의 없음을 의미함. L5는 양성 대조군과 음성대조군과의 비교에서 가장 유의한 차이를 나타냄 (P-value = 0.05 , 0.02 ).
요약하면, 삼채 복용에 따른 전체적인 미생물 양과 종의 변화는 미미한 것으로 관찰됨. 특히, 복용량(0.3 %, 0.5%) 에서는 전체 미생물 구성의 차이가 관찰 되지 않음. 그러나 leaf 0.5 % 을 복용한 닭의 맹장내 미생물의 구성은 대조군들과 큰 차이를 보이며 전체 미생물의 양과 종류 모두 변화가 일어난 것으로 관찰됨. 또한 삼채의 잎과 뿌리 복용이 미생물의 전체적인 구성을 각각 다르게 변화시킨다는 것을 알 수 있음.
Alpha-diversity Measures
샘플 내의 미생물구성이 얼마나 다양한지 알아보기 위해서, 샘플 내 미생물의 richness에 대한 지표인 observed OTU 와 diversity 에 대한 지표인 Shannon index를 분석함.
Richness는 부위별 수준별 그룹 들에서 ‘L3 vs 양성 대조군’을 제외하고, 그룹들 간의 차이가 없었음. L3는 양성대조군에 비해 더 많은 종류의 미생물들이 존재하지만, 음성대조군과는 유의한 차이가 없기 때문에 삼채 잎의 복용으로 인해 미생물의 diversity 가 증가하였다는 결론을 내리기 어려움.
Diversity는 ‘L3 vs 양성 대조군’ 과 ‘R3 vs 양성대조군’을 제외하고, 그룹들 간의 차이가 없었음. 이 또한 음성 대조군과의 차이가 없기 때문에 삼채의 잎과 뿌리가 diversity를 증가 시켰다고 하기 어려우며, 양성대조군에서 diversity가 약간 감소되었기 때문에 생긴 결과로 해석 할 수 있음.
Hookeri-associated microbiota changes
목적: 부위별 수준별 그룹들의 미생물의 양을 양성 대조군, 음성대조군과 비교함으로써, 삼채의 부위별 수준별 복용과 연관이 있는 미생물들을 발굴하고자 함.
요약:
*잎
1) L3와 L5에서, 음성대조군 또는 양성대조군에서 차이가 있는 미생물의 개수는 L5가 더 많았음. 이는 더 많은 양의 잎 섭취가 미생물의 양의 변화를 더 야기한다는 것을 의미함.
2) 음성대조군과 L3(또는 L5)에서 차이를 보이는 미생물들 중 대부분이 양성 대조군과도 차이를 보임. 첨가제를 복용하지 않은 음성대조군 뿐만 아니라 상업적 첨가제를 복용한 양성대조군과 차이가 나는 것은 첨가제로써 삼채 특이적으로 미생물들의 양이 변함을 의미함.
3) 몇몇 미생물들은 음성대조군과는 차이가 났지만 양성대조군과는 차이가 나지 않았음. 상업적 첨가제와 비슷한 효과로 인해 양이 변화한 미생물 임.
*줄기
1) 잎과는 다르게 음성대조군 또는 양성대조군에서 차이가 있는 미생물의 개수는 L3가 더 많았음. 이는 줄기에서의 0.3%는 0.5%와 미생물의 양을 변화시키는데 큰 차이가 없거나, 0.3%에서의 미생물 양의 변화가 더 효과적으로 일어난다고 추측할 수 있음.
2) 잎에서는 음성대조군에서 양의 차이를 보인 미생물들이 양성대조군에서도 차이를 보인 반면, 줄기에서는 공통적인 차이를 보이는 미생물들이 적거나 거의 없음.
3) 잎이 줄기에 비해 미생물의 양을 다르게 야기시킨 다는 것을 알 수 있음.
Correlation of gut microflora functions
목적: 육계의 체중(생산성) 및 경골 강도와 연관이 있는 미생물들을 발굴하고, 이 미생물들이 삼채의 복용과 관련이 있는지 밝혀내기 위한 분석.
요약:
*육계의 체중(생산성)
1) 통계적으로 유의하게 육계의 체중과 연관이 있는 10개의 미생물이 발굴됨.
2) Bacillus, Ruminococcaceae UCG-005, Gelria 는 몸무게와 음의 상관관계를 보이는데, 이 미생물들은 이전 분석 결과 삼채 잎의 복용과 연관이 있었음.
3) 또한, 몸무게와 양의 상관관계를 보이는 미생물들은 L5 에서 상대적으로 적은 양으로 존재하는 것을 확인 할 수 있음. 따라서 삼채 잎의 복용이 몸무게와 상관관계가 있는 미생물들의 양의 변화를 야기하였으며, 이로 인해 삼채 잎의 복용이 체중을 증가 시킨 것으로 추측 할 수 있음.
*경골 강도
1) 통계적으로 유의하게 육계의 경골 강도와 연관이 있는 15개의 미생물들이 발굴됨.
2) Parasutterella 는 가장 높은 양의 상관계수를 보이는 미생물로 이는 L5 와 연관되어 있는 미생물 임. 양의 상관 계수를 보이는 다른 미생물들에서도 L5는 더 많은 양을 보임.
3) 경골 강도와 음의 상관관계가 있는 미생물들 중 일부(from Ruminococcaceae UCG-010 to Ruminococcaceae )는 삼채의 섭취와 관련이 있어 보이나, 나머지는 삼채의 섭취와 관련이 없는 미생물 양의 패턴을 보임.
따라서, 육계의 체중과 경골 강도와 연관이 있는 미생물들 중 대부분은 삼채의 잎(특히 L5)의 복용과도 관련이 있을 것으로 판단됨.
분석 방법(M&M) 한글
1. 맹장 내용물의 DNA 분리 및 16s rRNA 시퀀싱
맹장 내용물 내의 미생물의 DNA를 추출하기 위해서, AccuPrep Stool DNA Extraction Kit가 사용되었다. DNA의 품질은 PicoGreen 과 Nonodrop을 이용하여 확인되었으며, 장 내 미생물 16s rRNA유전자의 V3, V4 지역은 PCR로 증폭되었다. Primer는 341F/805R (341F: 5’ CCTACGGGNGGCWGCAG 3, 805R: 5’ GACTACHVGGGTATCTAATCC 3’)를 사용하였다. 증폭된 16S rDNA의 정제는 qPCR Quantification Protocol Guide (KAPA Library Quantificatoin kits for Illumina Sequecing platforms)과 LabChip GX HT DNA High Sensitivity Kit (PerkinElmer, Massachusetts, USA) 가 사용되었다. MiSeq™ platform으로 300bp 길이의 paired end read가 생성되었다.
2. 장내 미생물 분류 및 분류된 균총 분석
PEAR, QIIME2 과 같은 소프트웨어를 이용하여 시퀀싱된 read를 병합하고, 퀄리티 컨트롤을 수행하였다. 병합된 read를 이용하여, 계통 분류를 수행하였다. 이때 Silva 데이터베이스 (Release 128)와 QIIME2 q2-feature-classifier plugin가 사용되었다.
다양성 지표인 alpha diversity 와 beta diversity 를 QIIME2 q2-diversity plugin를 통해 분석하였다. 샘플간의 거리를 계산하여 얻은 UniFrac matrix로 PERMANOVA을 수행하여 통계적으로 그룹간에 얼마나 구분되는지를 제시하였다.
3. 그룹간 다른 양으로 존재하는 미생물(DAM) 발굴
샘플간의 데이터 생산량을 보정하기 위하여, edgeR을 이용하여 미생물의 양을 보정하였다 (TMM normalization). 보정된 미생물의 양이 음이항분포를 따른다고 가정하고, generalized linear model (GLM)을 이용하여 통계 분석을 수행하여 삼채 급여와 관련 있을 것으로 예상되는 미생물(DAM)을 발굴하였다. 이 때, 통계적 유의성을 제시하기 위해서 false discovery rate (FDR)가 사용되었으며, FDR 0.05%를 기준으로 통계적 유의성을 판단하였다.
4. 미생물 양과 도계 생산성의 상관관계 분석
보정된 미생물의 양과 도계 생산성과의 상관관계가 Spearman 상관 계수를 이용하였다. 유의한 상관관계를 갖고 있는 미생물의 양은 히트맵을 통해 시각화 되었다.
5. 미생물의 기능 예측 분석 및 비교
미생물의 기능을 예측하기 위해서 Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states (PICRUSt) 프로그램이 사용됬다. PICRUSt 를 통해 미생물의 기능을 예측할 때, Greengene 데이터베이스로 OUT picking된 정보를 이용하였다. 예측된 기능은 Wilcoxon rank sum test를 통해 Control과 Leaf 0.5 그룹을 비교하였다.
